2D和3D分化的人诱导多能性干细胞来源的心肌细胞(hPSC-CMs) 2-8℃ 低温储存策略

摘要

本文评估了HypoThermosol-FRS（美国BioLife Solutions公司）溶液低温保存以2D单层和3D聚集体形式生产的hPSC-CMs的可行性，并研究了有效进行hPSC-CMs低温保存的时间范围。结果发现2D单层的hPSC-CMs在4°C下可有效地储存3天而不影响细胞活力，而以3D聚集体形式的hPSC-CMs比在2D单层组更能抵抗长时间低温储存诱导的细胞损伤，在储存7天后显示出>70%的高细胞回收率，且保持了CMs典型的(超)结构、基因和蛋白质表达谱、电生理谱和药物反应性。

实验流程简图

一、低温贮存对PSC-CMs活力和代谢活性的影响

1.1  2D单层hiPSC-CMs的低温储存

（1）hiPSC-CMs在HypoThermosol溶液中4°C保存3、5和7天（ S3,S5,S7分别代表储存后3天，5 天和7天；低温保存3,5,7天后进行继续培养，并评估后续细胞的活力恢复和代谢活性情况。

图1 2D单层hiPSC-CMs低温储存后细胞恢复情况

A）用台盼蓝染色法评价储存间隔和培养7天后的细胞恢复情况；

B）使用PrestoBlue测定法评估代谢活性恢复。

结论

·  2D单层hPSC-CMs在低温条件下保存3天后，可以获得高的细胞存活率(80%)；

·  随着冷藏间隔的增加，细胞活力下降，S5和S7条件下分别降至60%和50%。

（2）S7条件下，对第1天和第7天hiPSC-CMs的培养物进行活力检测。

图2 2D单层hiPSC-CMs低温储存后细胞代谢活性检测

其中二乙酸荧光素(FDA,绿色)标记活细胞和碘化丙啶标记死细胞（PI,红色)，并使用NucView caspase-3底物(红色)和MitoView线粒体染料(青色)，在S7培养物储存后第1天和第7天检测caspase-3活性。比例尺= 100mm

结论

·  细胞死亡主要发生在低温储存后培养的第0天至第1天，坏死和凋亡的细胞都有；

·  在储存及培养7天后，从低温中恢复的细胞具有活力，粘附在培养皿上，没有明显的PI/NucView染色；MitoView染色也突出了大量功能性线粒体的存在，显示出典型的心肌细胞特征。

1.2  3D聚集体形式hiPSC-CMs的低温储存

图3 hiPSC-CMs以3D聚集体形式低温储存后活力恢复检测与电镜分析

绿色(二乙酸荧光素，FDA)标记活细胞；红色标记死细胞（碘化丙啶，PI)

结论

·  低温保存以3D聚集体培养的hiPSC-CMs的细胞回收率比作为2D单层培养更高，从储存后的培养3天开始，S5和S7条件下的代谢活性恢复没有显. 著差异；

·  hPSC-CMs 在3D聚集体形式下，更能抵抗长时间低温储存诱导的细胞损伤，在储存7天后显示出>70%的高细胞回收率，且CMs保持了其典型的(超)结构；

·  在S5和S7的聚集体中未观察到坏死中心，并且在储存后第1天仅检测到少量随机分布在聚集体中的PI阳性细胞。

二、hiPSC-CMs以3D聚集体低温储存长达7天后的细胞表征

（1）低温储存和储存后培养1周，细胞通过流式细胞术(A)和免疫荧光染色(C)检测心脏特异性标志物。通过相差显微镜评估收缩活动的恢复。

图4 hiPSC-CMs 3D聚集体低温储存7天后细胞表征

A) 流式细胞术测定SIRPA、VCAM和cTNT（心肌肌钙蛋白）阳性细胞的百分比；

B) 在所有储存间隔(S3, S5, S7)后监测心跳频率(每分钟心跳次数)，直到储存后培养第4；

C) CMs特异性标记物分析:肌动蛋白、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和Titin(红色)。F-肌动蛋白用phalloidin标记(绿色)。Hochest复染标记细胞核(蓝色)。比例尺= 30mm。

结论

·  以2D单层和3D聚集体的形式储存的hiPSC-CMs ，在培养3-4天后恢复了正常的跳动频率；

·  hiPSC-CMs在低温储存7天后表现出典型的心脏形态，具有高度组织化的肌动蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T。

（2）低温储存后培养1周，通过透射电镜分析保存后心肌细胞的超微结构。

图5 透射电镜（TEM）检测低温保存后hiPSC-CMs的超微结构表征

结论

·  在储存间隔S7及培养7天后，无论是2D单层(图5A)还是3D聚集体培养的hiPSC-CMs（图5B）都没有显示出微结构损伤的信号（如细胞膜和细胞器受损），其超微结构特征与未低温储存的hiPSC-CMs相当（图5C）。

三、低温保存7天后hiPSC-CMs的功能表征

低温储存7天和储存后培养1周后，通过检测心肌细胞特异性动作电位(AP) (图6 A, B)、典型的心肌细胞对药物的反应(C-H)和钙瞬态(I, J)来评估细胞功能。

图6 hiPSC-CMs低温保存7天后的功能表征

结论

·  hiPSC-CMs经过7天低温储存后，保持了功能并表现出健康CMs的典型特征，包括几种离子电导：IKr，向外延迟变流器和Ca2+激活的K+电流；电压激活的l型Ca2+电流的间接“指纹；对变时剂的适当收缩活性反应。

总结

（1）本文开发和验证了对2D单层和3D聚集体形式的PSC-CMs有效低温保存策略；

（2）无论单层还是聚集体形式，低温保存7天不会影响人PSC-CMs的细胞表型和功能；

（3）hPSC-CMs 在3D聚集体形式下，更能抵抗长时间低温储存诱导的细胞损伤，在储存7天后显示出>70%的高细胞回收率，且CMs保持了其典型的（超）结构。

本文中BioLife Solutions公司的低温保存溶液HypoThermosol FRS对PSC-CMs的冷藏保存策略有两种，2D单层和3D聚集体。其中低温保存2D单细胞层PSC-CMs，将有助于交付经过认证、验证的、适合高通量心脏药物测试和毒性筛选的即用细胞板；而PSC-CMs 3D细胞球的1周储存策略，不仅可以允许现货型体外模型的分销，用于心脏毒性药物测试，还可直接用于心脏再生药物治疗的治疗型细胞。已有数据证明心脏祖细胞以3D细胞聚集体的形式递送可提高心脏损伤小鼠模型中植入细胞的体内存活率[3]。

因此，BioLife Solutions公司的低温保存溶液HypoThermosol FRS有助于克服再生医学市场和科学界的障碍和需求，为hPSC-CMs在全球临床和生物制药行业的商业化应用提供了可行性。

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参考文献

1. CORREIA et al. Effective Hypothermic Storage of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Compatible With Global Distribution of Cells for Clinical Applications and Toxicology Testing. STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 2016;5:658–669

2. Correia et al. Combining Hypoxia and Bioreactor Hydrodynamics Boosts Induced Pluripotent Stem Cell Differentiation Towards Cardiomyocytes. Stem Cell Rev and Rep (2014) 10:786–801

3. Bauer M, Kang L, Qiu Y et al. Adult cardiac progenitor cell aggregates exhibit survival benefit both in vitro and in vivo. PLoS One 2012;7:e50491.

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