发布时间：2023/10/09 点击数：缩小差距--人体微生理系统如何提高 NASH 药物发现的可转化性
本文亮点
1、CN-Bio的NASH MPS模型的全转录谱，相比于小鼠模型，与人类样本匹配度更高。
2、NASH MPS模型与其他模型对NASH治疗药物作用的效果比较表。
3、NASH MPS模型在可溶性炎症和纤维化生物标志物定量、免疫荧光染色和共聚焦成像等方面准确复制了近期临床试验中两种NASH治疗药物（Aramchol和Cenicriviroc）的效果。
前言
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的最严重形式，NAFLD 是在没有过量饮酒的情况下，由于饮食和生活方式而导致的肝脏中脂肪堆积的一系列病理变化的代谢性疾病,大约有20％被诊断为NAFLD的人从良性的肝脂肪变性到（NASH）， 伴随着脂肪变性、炎症、肝脏中免疫细胞的出现和胰岛素抵抗，肝损伤和肝细胞周围纤维化，最终可导致肝硬化和肝癌(图1)。
图1 - 人类肝脏NAFLD/NASH发展示意图
迄今为止，当前的临床前试验主要基于2D和体内动物模型，一直未能持续准确预测人体药物的有效性，因为它们缺乏可转化性，并且未能充分再现这种人类疾病的复杂性和多方面特性。
微生理学系统（MPS）通过复制人体器官的特性，提供了潜在的解决方案，CN-Bio的PhysioMimix NASH MPS模型由原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞共同培养，形成了3D微组织结构，位于灌注的肝MPS板中。
将CN-Bio的NASH MPS模型的转录组图谱与人类基因图谱数据库Human Gene Atlas database (www.ebi.ac.uk/gxa/home)进行比较，并以图形方式显示识别的目标，相比于小鼠模型，MPS的NASH模型的转录组学特征与来自人类样本的转录组学更具有相关性（图2）。
图2 - NASH MPS 模型的转录组学特征与来自人类样本而非小鼠模型样本的转录组学更具有相关性
我们先前已经通过验证两种抗NASH化合物对NASH MPS模型的效应，这些效应与临床研究结果一致，减少了炎症和纤维化1。在这里，我们进一步扩展了NASH MPS模型的验证，通过评估四种目前正在进行晚期NASH/NAFLD临床试验的抗NASH化合物的效应。
材料与方法
原代人肝细胞被植入3D支架中，该支架位于PhysioMimix Multi-chip Liver-12板内，并持续通过培养基灌注，以提供必要的营养、氧气和机械刺激。这种微环境有助于形成与生理相关的人类3D肝微组织，这些微组织表现出高度的代谢活性，并且能够在4周内保持生存。
肝MPS模型形成3D人肝微组织（图3）。
A）PhysioMimix Liver-12板的示意图，包括一个开放的细胞培养孔的横截面、3D支架和流体流动。
B）从单个细胞到3D肝微组织，在7天培养中的形成。
图3 - NASH MPS模型融合了三种经过验证的3D培养细胞：原代人肝细胞（PHH）、人类库普弗细胞以及星状细胞。这些微组织在含游离脂肪酸和糖的HEP-Fat培养基中培养，以诱导和维持NASH样的表型，持续培养14天（图4）。
图4 - 使用肝MPS模型产生类似NASH的表型。在HEP-Fat培养基中培养初级人肝细胞会生成类似NASH的表型。
使用了4种正在进行临床测试的抗NASH化合物，在三个不同的测试浓度下对我们的NASH模型进行了评估：Selonsertib（0.5、2和10 μM）、Aramchol（3.4、20.5和205 μM）、Cenicriviroc（0.7、4.3和43 μM）以及SB-431542（0.1、0.5和2 μM），其中最高浓度与临床试验所用的剂量相匹配。这些化合物在NASH MPS模型中的抗NASH效应进行了测量，包括炎症、纤维化和脂肪变性。这些化合物在10天内，以三个临床相关浓度，每两到三天一次进行投药。可溶性炎症和纤维化生物标志物使用Luminex测定，终点细胞外基质沉积情况则进行了检测。脂肪变性方面，并使用了免疫荧光染色和共聚焦成像进行了定量测量。
结果
01、抗NASH化合物对减轻NASH MPS中炎症和纤维化表型的剂量反应效应（图5），观察时间为第14天。从空载对照（VC）、Elafibranor（ELF，阳性对照）和4种抗NASH化合物的3个测试浓度处理的培养基样本中测定了IL-6（炎症）和纤维连接蛋白（纤维化）。所示数据为每个条件的N = 3。通过应用Kruskal-Wallis检验（单因素方差分析）确定了与空载对照相对的所有条件的统计显着性。
图5
02、总结抗NASH化合物在抑制炎症、纤维化和脂肪变性生物标志物方面的zui gao浓度的正面效应（图6）。从应用Kruskal-Wallis检验确定的P值的热图，包括第14天与空载对照相对的所有4种抗NASH化合物，包括纤维化（α-SMA和胶原蛋白1型）的共聚焦显微镜图像分析定量和肝小组织中脂肪积累，显示了它们在解决NASH方面的总体效果（NS-与空载对照相比没有显著差异；P <0.0001显示了针对NASH的最强的抑制效应）。所示数据为每个条件的N = 3。
图6
03、免疫荧光染色证实的NASH表型减少与共聚焦图像分析一致（图7）。A- 共聚焦显微镜成像显示了在第14天从使用VC，Elafibranor和4种抗NASH化合物的最高浓度处理的样本中收集的NASH小组织。样本在 4％的甲醛中固定，并用α-SMA（品红色），胶原I型（绿色），脂质（红色）和Hoechst（蓝色）染色。肝小组织中纤维化（α-SMA（B）和胶原I型（C））和脂质积累（D）的共聚焦显微镜图像分析定量。
图7
04、抗NASH化合物作用方式描述，及其在其他模型和我们的NASH MPS模型上对NASH关键特征的影响比较（表格1）。
表格1
结论
我们的NASH MPS模型准确地再现了近期临床试验中两种主要抗NASH化合物（Aramchol和Cenicriviroc）的效果。这说明NASH MPS模型为NASH治疗的药物效力提供了可转化的见解，同时也为临床前NASH筛选提供了有前途的敏感替代方案，有助于加速决策制定和市场准入。
推荐阅读
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参考文献
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