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介绍

Caco-2细胞（人类结肠腺癌）单层培养是一个公认的行业标准的体外模型，用于预测药物通过肠屏障的渗透性¹。药物渗透性在临床前药物研究中确定，是开发新疗法时的一个重要参数，因为它对达到系统循环的口服药物的量有影响。标准Caco-2模型由接种在静态培养皿中的多孔Transwell膜上的单层细胞组成，该膜将两个流体腔室（顶部和底部外侧）分隔开，Caco-2细胞形成极化上皮，具有紧密连接，在腔室之间形成屏障。

尽管广泛使用Caco-2 Transwell模型，但也存在公认的局限性。与人类小肠（50-100Ω/ cm²)²相比，Caco-2模型的跨上皮电阻（TEER）值通常高出一个数量级(1400-2000Ω/ cm²)。此外，Caco-2模型未能再现小肠的细胞多样性，仅表现为上皮成分。

近年来，人们一直在努力改进临床前药物开发和疾病研究中使用的体外模型，尤其是微生理系统（MPS），也称为芯片上的器官（OOC）的使用越来越广泛。MPS旨在更好地体现人体组织和器官系统的结构和功能特征。这是通过灌注细胞培养基来模拟组织中的血流，在3D支架中培养细胞和/或使用多种细胞类型来更好地反映细胞多样性来实现的。通过利用MPS创建更多转化相关模型，有机会改进用于预测药物渗透性的体外肠道模型。

目的

在这里，我们描述了肠道MPS的特征，并证明了其预测药物渗透性的实用性。使用 CN Bio的PhysioMimix单器官系统培养MPS模型 ，将上皮细胞（Caco-2）和杯状细胞（HT29-MTX）的混合物暴露于持续的液体流中，产生形态和功能的改变。我们计划研究液体流动和细胞多样性对肠屏障完整性的影响，目的是建立一个更接近人类小肠的肠通透性的MPS模型。

材料和方法

Caco-2和HT29-MTX细胞取自ECACC，并在标准DMEM中培养（外加10%FCS、1% 青霉素/链霉素、1%NEAAs和1%GlutaMAX）。对于Gut MPS模型，Caco-2/HT29-MTX 细胞以3：1 的比例在基底侧接种（PET Transwell insert，孔径0.4 um，Corning），总细胞数为50000个/孔。对于静态模型，仅在基底侧播种50000个Caco-2细胞/孔。在转移到PhysioMimix OOC MPS-T12板中培养18~25 天之前，肠道MPS最初在静态24孔板中培养1天 (Figure 1)。在更换培养基之前，每隔2-3天进行一次TEER测量，以评估屏障的形成/完整性，使用带STX2  chopstick探针的EVOM3 伏特计。

在屏障形成充分(>100Ω/cm²)后，评估荧光素黄在肠道屏障中的转运情况。在补充的Hank平衡盐溶液（HBSS）缓冲液中，在24孔板中进行转运研究，将200µM荧光素黄添加到基底侧腔室中，并在30、60、120和180分钟采集顶部样品，然后在荧光酶标仪中进行分析。

在Trizol试剂（Invitrogen）中收集细胞，并使用Trizol和和RNA纯化试剂盒（Invitrogen）遵循制造商的说明从每个样品中提取RNA。根据制造商的流程，使用带有RNase抑制剂（Applied Biosystems）的High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒合成互补DNA（cDNA）。通过RT-PCR对cDNA样本进行紧密连接（TJ）蛋白定量。

用TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)进行实时聚合酶链反应（RT-PCR）分析。通过编码3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的管家基因的表达来量化样本。使用Applied Biosystems Quant flex studio 6软件对结果进行分析。所有实验均在三个重复孔中进行，并至少重复三次。通过比较恒定荧光强度下的定量循环（Cq）值，对每个样品的数据进行分析。

对于成像，细胞被移除并在+4°C的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。然后在固定切片和石蜡包埋样品中测定粘蛋白-2（MUC2）和Zonula occludens-1 (ZO-1) 的免疫荧光信号。

对于免疫荧光成像，用磷酸盐缓冲盐（PBS）中的10%牛血清白蛋白（BSA）饱和Transwell膜10分钟，并用抗ZO1和抗MuC2单克隆抗体在+4°C下孵育过夜。然后将样品与二抗孵育1小时。其中抗羊免疫球蛋白G（IgG），耦联Alexa Fluor（594）（Invitrogen）用于ZO-1；抗兔IgG，耦联Alexa Fluoro（488）（Invitrogen，）用于MuC2。将膜与Aqua Poly/Mount抗褪色溶液封装在玻片上，在尼康EclipseTi荧光显微镜下观察。

石蜡包埋切片脱蜡并浸泡浓度降低的一系列醇。将载玻片在室温下封闭1小时，并在+4°C下在抗MUC2和抗ZO-1抗体中孵育过夜。然后将载玻片用含0.1%吐温-20的PBS冲洗三次，每次5分钟，并用二抗羊免疫球蛋白G(IgG) (耦联Alexa  Fluor (594) (Invitrogen)，用于ZO-1，以及二抗兔IgG(耦联AlexaFluoro(488)，(Invistrogen)，用于MuC2，孵育1小时。载玻片在随后的清洗程序后包埋，并在尼康Eclipse Ti荧光显微镜下进行检查。

为了进行药物渗透性评估，在二甲基亚砜（DMSO）中制备Atenolol, Verapamil-HCL  和Furosemide母液，并在补充的HBSS缓冲液中稀释至工作浓度200µM。在将200µM的适当化合物添加到Transwell的基底外侧隔室之前，将Transwell转移到24 孔板中的静态培养条件下，并在HBSS缓冲液中孵育30分钟。样品在30、60、120和180分钟时进行顶部采集，并在发送给Sygnature Discovery进行LC-MS分析之前 立即储存在-80°C下。N=每种药物3个Transwell。

结果

Figure 1. 肠道MPS概述

A. TEER评估肠道MPS和Caco-2培养物的屏障完整性，第7天后每隔2-3天读取一次读数

B. 板中的液体流动由PhysioMimix单器官系统控制

C. 上皮屏障需要18天才能形成，TEER用于评估屏障强度。肠道模型可用于第18至25天的实验，以评估药物化合物的渗透性、流量等参数。

Figure 2. 肠道MPS显示复杂的三维形态和生理相关屏障

A . 通过TEER评估肠道MPS和Caco-2培养物的屏障完整性，在第7天后每隔2-3天读取一次读数。

n=每个实验2-4个培养物。Error bars=standard deviation.

B. 在两个独立的实验中，在第18 天和第25天测量的肠道MPS的荧光素黄的表观渗透系数(Papp)，并与Caco-2静态培 养物进行比较。

n=每个实验2-4个培养物。Error bars=standard deviation.

C. 用qPCR检测肠道MPS和Caco-2静态培养物中紧密连接基因的表达，并用∆Ct表示。

n=每个实验2-4个培养物。Error bars= standard deviation.

D. 肠道MPS和Caco-2静态培养物石蜡包埋切片的组织学分析，用苏木精/伊红染色或通过免疫荧光显示紧密连接形成（ZO-1，红色）、粘蛋白生成细胞的表达（MUC2，绿色）和核定位染色(DAPI，蓝色)。

n=每个实验2-4个培养物。

Figure 3. 肠道MPS表达紧密连接和粘液

肠道MPS和Caco-2静态培养物的代表性图像染色显示紧密连接形成（ZO-1，红 色）、粘蛋白生成细胞的表达（MUC2，绿色）和核定位染色（DAPI，蓝色）。

Figure 4. 与静态Caco-2培养物相比，肠道MPS提高了药物渗透性的预测能力

通过定量LC-MS测定肠道MPS和Caco-2静态培养物中verapamil, atenolol, 和furosemide 的Papp，并与人体生物利用度进行比较³。

讨论

使用PhysioMimix单器官系统培养肠道MPS，及其功能特征和形态与标准静态Caco-2模型进行比较。在肠道MPS中, 内皮细胞和杯状肠细胞的混合物被接种到Transwell的基底外侧，并直接暴露于循环培养基中 (Figure 1A)。流体流动由PhysioMimix单器官系统控制（Figure 1B）培养物维持长达25天，分析窗口在第18天和第25天之间（Figure 1C）。

与静态Caco-2培养相比，肠道MPS的屏障完整性显著降低，并且更接近于在人体小肠中观察到的生理相关值 (50-100 Ω/cm²)² (Figure 2A)。当在第18天和第25天单独测试时，屏障完整性的降低转化为荧光素黄的较低渗透系数（Papp） (Figure 2B)。此外，与静态Caco-2培养物相比，肠道MPS模型的转录物显示与紧密连接相关的基因表达较低 (Figure 2C)。结合荧光素黄的Papp和TEER测量结果，表明肠道MPS屏障不太紧密，渗透性更强，因此符合体内观察结果。

组织学分析表明，静态Caco-2细胞在Transwell膜上形成一个单层细胞 (Figure 2D)。相比之下，含有Caco-2和HT29-MTX细胞混合物的肠道MPS暴露于连续的流体流中，组织深度增加，表明分化为具有潜在吸收功能的成熟肠细胞 (Figure 2D)。此外，荧光显微镜显示了模型中杯状细胞的作用，其诱导MUC2的表达，是小肠粘液屏障的基本组成部分(Figure 3)。

在肠道MPS和标准Caco-2模型中测定了具有不同人体体内生物利用度3的三种探针化合物的渗透性 (Figure 4)。肠道MPS能够确定所有化合物的肠道通透性值，每种化合物都具有不同的性质(Figure 4)。Furosemide 和atenolol 肠道MPS中的渗透性较低，与体内生物利用度数据相关性良好，而静态Caco-2相比与体内呈负相关 (Figure 4)，很快被吸收，两种模型之间大致相似(Figure 4)。

总之，动态共培养肠道MPS被证明显示了一个具有复杂三维形态、屏障完整性降低和粘液表达的更具生理相关性的肠道模型。与标准静态Caco-2模型相比，肠道MPS显示出更强的通透性，并且与受试药物的人体内生物利用度有更好的相关性。

通过培养原代细胞或干细胞衍生的肠细胞，可以进一步改进模型。此外，肠道MPS可以集成到CN Bio的PhysioMimix多器官系统中，与原代肝细胞共同培养，在单个实验板中研究肠-肝串扰以及联合药物吸收和代谢⁴。

参考文献

1. Huadong S, Chow E CY, Liu S et al., Expert Opinion on Drug Metabolism 2008; 4; 395-411

2. Srinivasan B, Kolli AR, Esch MD et al., J Lab Autom 2015; 20; 107-126

3. Lennernas H; Xenobiotica 2006; 37; 1015-1051

4. Abbas Y, Kostrzewski T, Hughes D, https://landing.cn-bio.com/multi-organ-appnote