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细胞治疗因其具体独特的靶向作用和长期疗效，成为新药研发的热点。随着细胞疗法逐渐步入临床试验，细胞培养尤为重要，从而对细胞培养基补充剂的需求也越来越大。胎牛血清（FBS）一直以来被作为是细胞培养的常用补充剂，遗憾的是涉及伦理和安全问题。如今，从加工过的血液中提取的人源培养基补充剂已经得到越来越多的使用。人血小板裂解液（hPL）是可用于临床和商业化制备细胞治疗产品的补充剂之一。hPL来源于混合人的血小板，经连续反复多次的冻融裂解获得，其含有的生长因子和细胞因子与胎牛血清（FBS）和人AB血清相同且含量相当。

另一方面，细胞治疗的人原代细胞体外培养及扩增并非易事，国家食品药品监督管理总局组织制定的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》中有明确指出：“细胞培养过程中，应尽量避免使用动物来源的物质，比如应尽量避免血清的使用，若必须使用血清，需要提供相关的研究资料说明使用的必要性和合理性；严禁使用疫病流行区来源的动物血清；不得使用未经过安全性验证的血清”。

因此，探索更加安全、成分更加明确的血清替代物对于细胞治疗产品的稳定持续生产至关重要。

01 E-beam原理和传统γ-辐照技术

一般而言，血小板（hPL的制作原材料）相关的筛查和测试标准是与输血前血液筛查相同。我们知道，传染性病原体（特别是人类传染病病毒）的传播是人类血小板衍生产品（如hPL）的一个考虑因素，且多个供体的混合血小板裂解液虽可提高hPL批间一致性和性能，但同时增加了病毒污染的风险。

通常，医疗和食品通过电子束（E-beam）或γ射线辐照灭杀病毒。有研究表明，通过γ照射hPL能有效地灭活病毒，但会造成hPL的部分生长因子丧失、不良的产物特性（如浑浊现象），以及细胞扩增效能降低的影响。因此，通常还需通过添加蛋白质稳定剂等额外的步骤来减轻不良影响，但又可能会引入新的风险问题。

图1 Sexton品牌病原体减少PR工艺设计流程

与传统的γ辐射方式不同，美国Sexton公司生产了一种pathogen-reduced病原体减少的hPL (PR hPL)，采用电子束照射（E-beam）的过程来降低病毒传播的风险。E-beam原理：通过电子束直接作用，电子束激发水分子产生羟基自由基、还原性水合电子等活性粒子的氧化-还原的间接作用，对包括病毒等微生物体内的DNA或RNA分子以及蛋白质包膜产生破坏，进而达到病毒减少工艺的作用效果。

美国Sexton PR系列产品，依照国际人用药品注册技术协调会ICH/295/95和世卫组织WHO相关附件被用作设计病毒清除验证的指南，建立待验证工艺的缩小模型，将工厂生产的nLiven PR，运送到测试实验室，在待验证样品中人为地加入一定种类和数量的病毒（针对血浆来源常规的代表性模型病毒）。然后产品进行病毒去除/灭活工艺步骤，处理，并返回到测试实验室进行病毒减少验证分析。

图2 Sexton品牌病原体减少PR工艺设计流程

通过对经PR工艺处理的Sexton PR系列hPL产品进行生长因子水平和病毒测试（流程见图2：左图是E-beam处理hPL后的生长因子分析和细胞扩增实验，右图是E-beam处理hPL后的病毒分析），可证明PR工艺可以实现在不显著影响hPL组成和hPL功能的情况下，实现病原体减少，发挥良好的细胞培养补充物性能。

02 实验部分

1. 细胞因子水平验证

针对以下的常见hPL中的细胞因子，使用ELISA法对普通hPL（蓝色）和电子束辐照的nLiven PR（红色），分别进行3组重复分析求取平均值，用以评价PR工艺对hPL产品细胞因子含量的影响。

图3 PR工艺的hPL中FGF/EGF/PDGF-AB/ TGF-β/ PDGF-BB水平比较

实验发现：除了3A图中的FGF水平，其他细胞因子（如3B图中的EGF、3C图中的PDGF-AB、3D图中的TGF-β以及3E图中的PDGF-BB）在通过电子束照射（E-beam）的PR工艺获得的hPL中的含量与普通hPL对比是相对偏高的。

2. 细胞扩增生长验证

实验人员以BM-MSCs培养实验为例来验证PR工艺hPL的产品性能。

图4 PR工艺的hPL与其他补充剂的细胞扩增数目与形态比较

将BM-MSCs以2X10*4个细胞/孔的密度接种在12孔板中，培养4~5天，收获后计数。比较在含有hPL、PR hPL和γ-辐照FBS的培养基中培养的BM-MSCs的细胞增殖率。

BM-MSCs相对细胞扩增数结果比较：Sexton品牌的Stemulate产品和PR工艺的nLiven PR产品相对于γ-辐照的FBS组获得更多的细胞扩增数目。BM-MSCs细胞形态比较：Sexton品牌的两款hPL相对于γ-辐照的FBS细胞生长更为致密和均一。

3. 病原体减少工艺的验证

使用牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行标准病毒空斑试验，用以评估生产工艺去除/灭活病毒的能力，进行相关病原体减少/去除效果的验证。主要在应用电子束处理病原体步骤之前，将BVDV刺突病毒引入样品，然后对经电子束处理过的样本进行残留病毒分析。如下图表中所示PR工艺的hPL的显示模型包膜病毒BVDV减少了6个对数值。

图表 病原体减少结果

4. 其他PR工艺的hPL生化指标

图5  PR工艺的hPL关于渗透压、pH以及总蛋白的批间一致性数据展示

结果显示：美国Sexton品牌的nLiven PR血小板裂解液使用E-Beam进行病原体处理的产品关于渗透压、pH以及总蛋白的32个批次的一致性数据展示，可见CV值小于10%，展现了nLiven PR产品良好的批次间一致性。

03 文末结论

通过实验验证，在Stemulate或nLiven PR中生长的BM-MSCs始终显示出强劲的细胞扩增，nLiven PR尤为明显。在其他干细胞扩增实验中，结果也如此。

图6 Sexton品牌的nLiven PR、Stemulate以及T-Liven PR产品

Sexton Biotechnologies的nLiven PR是一种经过验证的、强大的病原体减少工艺处理的产品，为细胞培养提供一致的、高质量的培养基添加物。与nLiven PR不同的是，Sexton公司的T-Liven PR是PR处理的血小板裂解液的封闭袋装系统版本，包括T细胞生长验证试验的放行测试，确保免疫细胞培养过程中的细胞质量。

有趣的是，T-Liven PR在被应用于T细胞等免疫细胞相关治疗时，对于CAR转导T细胞的表型也被发现具有显著的优势。(Torres-Chavez等人2019年，请联系40469太阳集团com生物获取相关文献资料)