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通过丹磺酰基化（Dansylation-based）测定法对基于质谱的蛋白质组学和代谢组学的器官芯片样本进行归一化

本文亮点

本文介绍了美国国家科学院发表的一篇使用CN-Bio的肝脏芯片系统对 VX（一种极度危险的神经毒剂，化学战毒剂）进行代谢组学研究。该研究团队用一种基于丹磺酰的测定方法，结合部分标记代谢物，允许在采集前进行归一化，更好地关联器官芯片平台中真正发生的生物学扰动。

前言

芯片实验技术已经迅速发展，并且通过使用基于质谱的多组学分析，这种技术变得更加强大。这种分析非常适合芯片实验格式的样本有限的特性。在我们的研究中，器官芯片技术使我们能够在不使用模型生物的情况下实现高通量实验，同时允许我们关注器官和亚器官系统。

然而，这些器官芯片平台的一个常见问题是由于诸如板边效应、细胞不同步、流出液流等因素导致蛋白质组和代谢组在不同孔之间或不同芯片之间的变异性，这会导致样本的多组学定量分析具有高度的变异性，可能掩盖了系统内真正的生物学变化。虽然通过增加样本数（N）可以克服这种变异性，但这样做也会增加成本和人力。我们反而寻求改进我们的归一化方法来规避这个问题。

在这里，我们利用英国器官芯片供应商CN-Bio的肝脏芯片来研究 VX（一种极度危险的神经毒剂，化学战毒剂）暴露后的作用机制、毒性和宿主反应。为了对抗芯片间的变异，我们开发了一种分析和归一化CN-Bio肝脏芯片的方法，利用Dansylation和BCA测定实现代谢组和蛋白质组的归一化。这种策略导致了变异效应的减少，使我们能够得出更有统计信心的结论，并观察到由实验条件而非系统性芯片间变异引起的趋势。这种方法可以很容易地扩展到其他器官芯片的组学分析。

研究方法

如上概述图

1、细胞培养。

人肝细胞被培养在CN-Bio（CN Bio Innovations Ltd）的肝脏器官芯片系统上，并暴露于20μM VX，同时还有未暴露的对照组。归一化的样本组进行了测定，而未经归一化的样本组经历了相同的样本制备，但没有使用测定定量。

2、采集前归一化。

2图左：BCA和肽酶测定（BCA & Peptide Assay）。蛋白质从代谢组分离出来，进行了消化前和消化后的测定，然后根据测定结果进行了归一化处理。

2图右：丹磺酰化测定（Dansylation Assay）。代谢组分被丹磺氯化物标记，并根据标准曲线进行测定，然后进行了归一化处理以使其与浓度最低的样本一致。

3、质谱分析。

经过归一化和未归一化的样本集在Thermo Eclipse质谱仪上进行了分析，使用了FAIMS接口以正模式（用于蛋白质组学），或者在Thermo QExactive Plus Orbitrap质谱仪上进行了分析，包括反相正离子和负离子模式以及HILIC正离子和负离子模式（用于代谢组学）。

4、统计分析和Joint Pathway分析。

来自归一化和未归一化数据集的蛋白质和化合物经过筛选，筛选条件是校正p值 ≤ 0.05。筛选后的数据被输入到Metaboanalyst的联合途径分析中，采用Fisher’s Exact Test用于富集分析。

结果与讨论

1、正离子模式质谱中反相色谱的变异系数。

图1：A) 未归一化（红色）和归一化（蓝色）对照样本的叠加，以及B) 未归一化（红色）和归一化（蓝色）VX暴露样本的叠加。两个图表中的曲线都是密度线。

2、反相正离子模式特征的叠加，这些特征被确定为显著（p值≤0.05）。

图2：曲线是密度线

3、反相正离子模式下，由于归一化而产生不同结果的选定代谢物的箱线图。

图 3：A) 未归一化和归一化样本中的1,3-二甲基丁基胺，B) 未归一化和归一化样本中的L-谷氨酸，C) 仅在未归一化样本中的1,3-二甲基丁基胺，D) 仅在归一化样本中的1,3-二甲基丁基胺。

4、对被定义为显著的蛋白质组学和代谢组学数据（调整后的p值≤0.05）进行Joint Pathway分析。包括未归一化（A）和归一化（B）样本。归一化样本结果显示，有更多与VX暴露生物学相关的通路显著富集。

结论

器官芯片系统允许更精确地理解毒素、环境危害或潜在药物对细胞力学的影响，可以以更经济、更高通量的方式实现。然而，为了从这些样本中获得更确定的结果，应该采用归一化策略。

在采集数据之前对代谢组样本进行归一化处理，使对照样本在 0-50 范围内的 CV 值降低了两倍多。这样就能鉴定出变化更明显的代谢物，从而阐明受 VX 暴露影响的代谢途径。同样，归一化蛋白质组样本也鉴定出了与受 VX 影响的生化功能相关的蛋白质。

最后，当归一化的蛋白质组和代谢组数据结合在一起时，VX 暴露更准确的图谱就会出现，Joint Pathway富集就证明了这一点。在归一化数据集中，超过 80 条通路被确定为具有重要意义，这表明 VX 对细胞群的影响更具特异性，而不是在非归一化数据中被认为具有重要意义的非特异性系统。

参考文献

1.Erin M. Gallagher, Gabrielle M. Rizzo, Russell Dorsey, Elizabeth S. Dhummakupt, Theodore S. Moran, Phillip M. Mach, Conor C.Jenkins,Normalization of organ-on-a-Chip samples for mass spectrometry based proteomics and metabolomics via Dansylation-based assay,Toxicology in Vitro,Volume 88,2023,105540,ISSN 0887-2333,https://doi.org/10.1016/j.tiv.2022.105540.

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