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本文概况

来自 Imperial College London 的研究团队使用 CN-Bio的器官芯片系统构建了一种能够剖析乙肝病毒（HBV）全生命周期的系统。该系统可以维持至少40天，可以重现HBV生命周期的所有步骤，包括患者源HBV的复制和HBV 的cccDNA，研究发现，感染HBV后的先天免疫和细胞因子反应与在HBV感染患者中观察到的反应相似，因此可以分离对免疫逃避和生物标志物验证重要的途径。此外，本研究还证明人原代肝细胞(PHH)与其他非实质细胞的共培养能够鉴定免疫效应物的细胞来源，从而为HBV研究提供了一个有价值的临床前平台。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染与肝硬化和肝癌的发展密切相关。目前临床上控制乙肝的药物（如拉米夫定、恩替卡韦、替诺福韦）主要是靶向 HBV 基因组子代病毒体内的逆转录前体核酸（pgRNA），但这已经代表了乙肝感染的晚期，不会消除 HBV 的双链 DNA（cccDNA）。HBV生命周期的研究一直很复杂，主要是由于缺乏合适的体外模型来概括肝细胞中病毒生命周期的所有步骤，以及难以为HBV复制建立生理上完整的宿主细胞模型。

肝细胞是 HBV 的靶细胞，由于肝脏是一个复杂的 3D 结构，即使有原代肝细胞（PHH）作为疾病模型静态培养，但它们也会在培养过程中快速去分化（形态改变、CYP450酶活性丧失等）。虽然目前的一些改进型模型能显示出HBV 感染的某些方面，但局限性也非常明显，具体有：

1.对患者来源的HBV病毒不敏感，仅支持短暂的低水平感染，或启动感染需要非常高的病毒滴度（高MOI），且需要二甲基亚砜（DMSO）和聚乙二醇（PEG）以增强病毒结合，或使用免疫调节剂，包括Janus活化激酶/信号转导子和转录因

子激活子（STAT）抑制剂；

2.大多数利用HBV感染PHH培养模型的研究需要在培养长达15天后才能进行分析，此时大多数PHH已经去分化；

3.很少有系统可以研究免疫反应和宿主/病原体间的相互作用，表达 HBV 的癌细胞系生理相关性很有限，人源化小鼠模型脆弱、实验进展缓慢且成本昂贵。

微生理系统（MPS），通常被称为“器官芯片”（organ-on-a-chip），已经成为在临床前药物研究中获得相关人体数据的有前途的工具。它们旨在通过在3D支架中培养细胞，并在灌流条件下模拟血液流动，来复制人体组织的结构和功能特性。 

研究目标

在这里，我们描述一种新的HBV 3D PHH 培养模型，与传统的静态2D PHH培养物、SACC PHH（由PHH和小鼠成纤维细胞系NIH3T3-J2组成）和3D肝球体相比，3D PHH 培养模型通过微流控培养（MPS），肝细胞能够在更长的时间内保持功能性，允许用患者来源的HBV在低滴度情况下感染PHH。除了促进宿主和病毒遗传学的研究外，该平台还应该能够使用PHH/Kupffer共培养物剖析复杂的宿主/病原体相互作用，并验证HBV感染的生物标志物、治疗反应或潜在的治疗干预。

结果与讨论

1、3D PHH 长期培养形成生理性肝微组织

为了模拟肝窦上的PHH组织，我们使用微流控循环灌注有胶原涂层的聚苯乙xi支架（图 1），培养基以1μL/s的速度再循环为培养物提供稳定水平的营养和氧气，这是传统二维（2D）PHH培养物的主要障碍之一。

图1：微流控灌注示意图，其中培养基通过气动微泵再循环，放大图为用于细胞粘附的胶原涂层支架。每个板由12个这样的孔组成，其中培养液流速可调节。

几种模型中，3D PHH和3D球体培养物保持活力并表现出稳定的形态和表型时间较长，其中 3D PHH至少40天，与传统的静态2D PHH培养物和SACC PHH（由PHH和小鼠成纤维细胞系NIH3T3-J2组成）相比，后者在10-13天内表现出形态去分化，并且3D PHH 在培养2周后，与2D或SACC PHH相比，产生约10倍高水平的肝细胞特异性标志物白蛋白（图2）。

图2：a:接种后3天在3D支架中接种后PHH的细胞活力。

b：3D PHH与3D球体、静态2D PHH和SACC PHH肝细胞形态的比较。

c:培养14天后，2D PHH、3D球体、SACC PHH和3D PHH培养物中白蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光显微图。

d:通过ELISA定量培养14天后从2D PHH、3D球体、SACC PHH和3D PHH培养物中分泌白蛋白。

同时，3D PHH培养物中的总白蛋白水平和每细胞白蛋白分泌动力学与3D球体培养物相当，并随着时间的推移保持稳定（图 3）。

图3：不同肝细胞培养模型的纵向白蛋白分泌。

为了进一步表征3D PHH培养物的代谢功能，我们比较了在2D、3D球体、SACC PHH和3D PHH中生长的PHH中关键Cyp450的mRNA水平，包括I、II和III期酶，总体而言，只有2D PHH 在培养2周后表现出较低或不存在Cyp450基因水平，3D球体和3D PHH培养物显示Cyp450水平与新鲜解冻的PHH相当。(图4)。

图4：培养14天后,各模型及新鲜解冻的PHH和HepG2细胞的细胞色素P450基因（HNMT、CYP2A6、SLC22A1、CYP2A13和GSTP1）mRNA表达比较。

为了测试3D PHH的代谢活性，在培养7天后评估了6 个不同肝细胞供体中CYP3A的生物活性，并显示出一致的CYP3A活性（图 5a）。此外，在接种PHH后7、14和21天，对CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4代谢其各自底物的能力进行了评估，图5b表明3D PHH的功能完整维持。DPPIV/CD26的稳定分泌，胆管的标记物和用5-CDF染色的培养物进一步证明肝胆管是功能性的并维持较长时间。对在3D PHH培养中生长了20天的PHH进行超微结构分析，发现了类似肝窦的结构特征，包括胆汁小管和紧密连接的形成（图5c-f）。

图5：a:3D PHH 6个肝细胞供体培养7天后的CYP3A活性。

b:3种代谢酶的代谢活性定量。

c:通过Luminex测定的3D PHH培养物中胆管标记物DPPIV/CD26的稳定维持.

d:CDFDA染色测定胆管功能。

e、f:培养20天后通过透射电子显微镜对3D PHH进行的超微结构分析。

（实心箭头：胆管。空心箭头：肝微绒毛。星号：紧密连接。L：脂滴）

2、3D PHH 易受长期HBV感染

为了评估3D PHH是否可以感染HBV，将3D PHH与患者来源的HBV以100GE/cell的MOI孵育，然后在感染后10天通过免疫荧光检测HBcAg和HBsAg，这表明大多数细胞被感染， 且在相同病毒滴度下各模型对 HBV 的易感性也不同（图6-a）。HBsAg和HBV DNA的产生在感染后至少22天内是稳定的（原文献影片6）。

图6：a: 使用患者源HBV（100GE/cell）感染3D PHH后10天，通过免疫荧光检测左组图：HBsAg和HBcAg，以及右组图：使用HepDE19衍生的蔗糖纯化HBV（500GE/cell）感染后12天的3D PHH培养物，3D球形培养物和SACC PHH培养物中的HBcAg。

当使用如HBsAg和HBV DNA的分泌所证实的低至0.05GE/cell 时，只有3D PHH培养基仍然容易被感染，同时对HBV感染的启动和维持不需要使用PEG或DMSO，并且firstly证明在体外导致稳定的HBV感染的MOI为0.05GE/cell低于定量限度（图6-b、c）。

图6：b: 通过检测分泌的HBV DNA，比较3D PHH培养物与3D球形培养物（左）和SACC PHH培养物（右）在感染HepDE19衍生的蔗糖纯化HBV时的敏感性。

c: 在3D PHH培养物感染蔗糖梯度纯化的HepDE19衍生HBV后，HBV DNA和HBsAg的纵向累积分泌。

从感染患者来源的HBV的3D PHH培养物中纵向释放HBsAg和HBV DNA导致病毒标志物和复制中间体的稳定增加（图 7a-c）当用HBV逆转录酶（RT）抑制剂替诺福韦-阿拉非那酰胺（TAF）治疗时，HBV DNA分泌迅速减少，而抗原表达保持稳定，这表明与HBV感染患者类似，RT抑制剂是无效的(图 7 d)。

图7：肝细胞培养的HBV感染导致HBV复制中间体的积累。

a：具有100GE/cell患者来源的HBV感染3D PHH第 2 天和第 10 天的 sgRNA和 pgRNA；

b-c:其他模型的感染情况；d:在1μM替诺福韦-阿拉非那酰胺（TAF）治疗3D PHH10天检测HBeAg。

3、3D共培养中 Kupffer细胞的功能性

研究表明，IL-6主要由巨噬细胞产生，在抑制HBV转录活性方面发挥重要作用。然而，HBV感染的患者没有检测到IL-6或TNF-α的表达。为了解决肝脏内非实质细胞群对HBV感染的影响，我们进行了3D PHH和原代Kupffer(KC)细胞的共培养。我们使用PHH单一培养和KC与PHH共同培养。为了评估KC的功能，我们在接种后11天用1μg/mL脂多糖（LPS）刺激3D PHH和3D PHH/KC共培养物，并在第12天分析IL-6和TNF-α的蛋白质水平。正如预期的那样，只有共培养物分泌高水平的IL-6和TNF-α，表明KC在整个培养期内保持功能（图8a,b）。用100GE/cellHBV感染3D PHH和3D共培养物会导致明显的急性期反应，这一点仅在PHH/KC共培养物中表现为高水平的C反应蛋白（图8-c），这已被证明是由巨噬细胞产生的。

图8：a、b: 3D PHH和3D PHH/KC共培养物对接种后11天添加的1μg/mL LPS的反应，通过刺激后24小时测量a IL-6和b TNF-α来确定。

c:感染患者来源的HBV（100GE/cell）后KC引发的急性期反应，通过使用Luminex测量C反应蛋白来确定。

紧接着，我们评估了KCs是否仍对外源性刺激有反应。3D PHH培养物本身对HBV感染不产生任何IL-6和TNF-α，因为这些细胞因子是KC特异性的（图9a）。然而，HBV感染的患者表现出IL-6和TNF-α的血清水平升高，表明有促炎免疫反应（图9b，c）。对细胞因子和趋化因子分泌的分析显示，HBV感染的共培养物，类似于3D PHH单培养物，不会分泌IL-6和TNF-α来应对HBV感染（图9d，e）。然而，即使在感染HBV后8天，当通过LPS施加外源性刺激时，KC也会迅速分泌IL-6和TNF-α（图9e）。有趣的是，与未感染的培养物相比，感染HBV的LPS诱导的IL-6反应明显更强，这表明即使HBV有效地阻断了PHH中的大多数先天免疫激活，它也不能破坏非实质细胞的外源性激活。此外，这种LPS诱导的先天免疫激活能够通过减少HBsAg的分泌抑制HBV的复制（图9f），而这并没有引起LPS诱导的细胞毒性或IL-6诱导的增殖，如通过白蛋白分泌所示（图 10），这表明外源抗原可能参与引发对HBV感染的免疫反应。这些证明了3D PHH/KC共培养可以用来解析肝脏驻留细胞类型对HBV抗病毒反应的贡献。

图9：Kupffer细胞对HBV感染的反应需要外源信号。

a感染患者源性HBV（ƒ）的3DPHH培养物中TNF-α和IL-6的纵向分泌。

b、 c HBV感染患者和健康对照者血清b TNF-α和c IL-6水平以及与血清HBsAg水平的相关性。

d–f感染患者源性HBV（100 GE/细胞）的3D PHH培养物和3D PHH/KC共培养物中d TNF-α和e IL-6以及f HBsAg的分泌。

感染后8天用1μg/mL LPS处理培养物，LPS刺激后24小时用Luminex定量TNF-α和IL-6水平，并在LPS刺激后48小时测定HBsAg分泌。所示数据为三个独立实验的平均值±SD（*p＜0.05，***p＜0.001；Bonferroni后验的双向方差分析）

图 10：在 3D PHH 和 3D PHH/KC 共培养物中白蛋白的产生是稳定的。

HBV感染或1µg/mL LPS治疗不会影响感染后10天的白蛋白分泌。显示的数据为三的平均值±标准差独立实验。

结论

1.3D PHH模型能够概括HBV生命周期的所有步骤，包括患者来源的HBV的复制和HBV cccDNA的主要维持。

2.3D PHH模型感染HBV后的先天免疫和细胞因子反应与在HBV感染患者中观察到的反应相似，因此可以分离对免疫逃避和生物标志物验证重要的途径。

3.证明PHH与其他非实质细胞的共培养能够鉴定免疫效应物的细胞来源，从而为HBV研究提供了一个有价值的临床前平台。

本文详细的材料、研究方法、支持资料可参考文献：

Ortega-Prieto, A.M., Skelton, J.K., Wai, S.N. et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nat Commun 9, 682 (2018). https://doi.org/10.1038/s41467-018-02969-8