发布时间：2024/01/04 点击数：干细胞再生药物已展现广阔的应用前景，这对细胞治疗产品临床至上市阶段的工业化生产提出了要求，且生物反应器被认为是较大规模进行干细胞生物制造的理想平台。为了减少产品污染的风险，监管机构也更推荐使用一次性生物反应器。本文就已报道的一次性生物反应器应用、各自优缺点，以及在未来生产中的挑战进行概述。
一、干细胞生物制造的一次性生物反应器
01 一次性搅拌槽生物反应器
(Stirred-tank bioreactors ,STBRs)
搅拌槽生物反应器是在多种细胞类型(包括细菌、昆虫、植物或动物细胞)中生产病毒或重组蛋白等产品最常用的装置之一。STBR通常采用玻璃或不锈钢材质，其内部沿生物反应器高度有一个或多个叶轮，以确保培养基的有效搅拌(图1)。数十年来，STBR在生物制药行业的使用确保了该类生物反应器在搅拌剖面、剪切应力、功率耗散和氧传质方面有很好的特征描述，具有完善的经验相关性，以及确定的放大标准。
然而，STBRs中存在高剪切力的“热点”以及混合较差或未混合的“死区”。这种不均匀的水动力学混合环境可能会因为高剪切力本身造成细胞过度分化，或细胞沉降形成部分非常大的细胞聚集体而发生细胞凋亡。
文章综述了10毫升实验室规模到200升生产规模的应用，包括（1）BioBLU（125 mL）、Mobius CellReady（1.5L）中进行hiPSCs扩增；（2）在STBRs中进行PSC-心肌细胞分化探索；（3）在Mobius CellReady、UniVessel SU和CultiBag STR生物反应器中进行微载体粘附的hMSC扩增；（4）也有在Ambr15生物反应器系统中进行人造血干细胞/祖细胞(hHSPC)扩增的多种条件测试以及无血清培养基中基于微载体的BM-hMSC扩增测试。具体细节可参见原文章【1】。
图1. 搅拌式生物反应器容器及控制原理图
02 固定床生物反应器
（Fixed-Bed Bioreactors）
固定床生物反应器是食品和废水工业中常见的主要装置，容器内充满大孔材料或大珠，细胞或酶可以附着在上面，液相可以通过它连续通过(图2)。
与搅拌槽生物反应器相比，其几何形状和配置使其具有较大的表面体积比，占地面积小，具更高的单位体积生产力，这些特性对于培养锚定依赖性的哺乳动物细胞有利。但由于缺少叶轮和搅拌，传递给细胞的剪切应力很低的同时，事实上更容易在生物反应器内形成营养物、代谢物、生长因子、氧气等物质的浓度梯度（一定程度上反映出培养环境的不均一性），且生长监测困难。
文中综述了该系统应用于哺乳动物细胞病毒生产和少量hMSC扩增的案例，如使用固定床生物反应器系统-Fibrastage瓶(已停止使用)用于扩增人脐带血来源的hMSCs，一个500mL的FibraStage瓶，培养7天可产生(4.15±0.81)× 108个细胞【1】。
图2. 固定床生物反应器图示
03 中空纤维生物反应器
(Hollow Fibre Bioreactors)
中空纤维生物反应器由许多毛细管组成，与固定床生物反应器类似，具有高表面积和低占地面积（图3）。在中空纤维生物反应器中，细胞粘附在毛细管表面，培养基和试剂可以通过粘附细胞的环泵送，而气体和小分子（例如葡萄糖、乳酸）可通过半透的毛细血管膜扩散。中空纤维反应器中可获得高细胞密度及其产生的高产物滴度使其得到重组蛋白、单克隆抗体和病毒生产行业的青睐，同时还可用于废水处理和生物催化反应。但相对较高的成本、难以监测细胞生长以及容易受到污染是它的一些劣势。
文中综述提到了Quantum Cell Expansion System (QES; Terumo BCT)在干细胞方面的应用，包括hESCs和hiPSC的扩增，GMP级神经干细胞（hNSCs）的生产和各种来源的hMSC的培养。该封闭的全自动系统由大约11500根中空纤维组成，为细胞生长提供了2.1平方米的表面积（相当于120个T-175烧瓶)，占地面积为0.3平方米【1】。
图3.中空纤维生物反应器系统原理图及中空纤维组件特写
04 旋转细胞培养系统
(Rotary Cell Culture System, RCCS)
旋转细胞培养系统是NASA开发的一种高纵横比的圆柱形生物反应器，可用于微重力环境下的细胞培养(图4)。培养基与容器本身以相同的速度旋转，这将使地球引力对容器内粒子的影响最小化，从而产生10-2 x g的有效引力。因此，细胞可以在层流状态下悬浮培养，具有最小剪切应力(<5 x 10-2 Pa)，且由于缺乏顶部空间剪切力进一步减小，因此不会形成气泡。虽然RCCS传递的低剪切应力限制了剪切引起的细胞损伤，但RCCS传递的低剪切应力降低剪切引起的细胞损伤的同时，也更大程度地限制了对流传质（在RCCS中，主要是指扩散传质），这导致细胞附近形成低营养浓度和高废物堆积的微环境。一次性RCCS系统由synconon公司商业化，目前只有10毫升和50毫升的规模，规模扩展性方面限制较大。
文中综述了hESC衍生的hNSC在RCCS中的培养，模拟微重力观察其对这些细胞发育的影响，另外也有成人BM-hMSCs在该生物反应器中的培养研究【1】。
图4.旋转细胞培养系统示意图
05 旋转床生物反应器
(Rotating Bed Bioreactors)
旋转床生物反应器在固定床系统基础上加上旋转作用-细胞粘附在容器内旋转的板上(图5)。其应用包括生物催化、废水处理以及在哺乳动物细胞培养。该类生物反应器可以在满容量下运行，类似于滚轮瓶，但不完全填充容器，其可以允许细胞间歇性地接触培养基和顶空，具有较大的表面体积比，向细胞传递较低的剪切应力，通过旋转的方式为培养物提供了更多的均匀性，与灌注兼容。但其缺陷是在培养过程中不能进行细胞收集和监测。
文中综述了RP 2000 H生物反应器（125mL规模）被用于UCM – hMSC扩增，以及旋转床生物反应器（340mL）被用于处理人脐带动脉细胞(HUCACs)的实验过程【1】。
图5.旋转床生物反应器示意图
06 摇摆生物反应器
(Rocking Motion Bioreactors)
摇摆生物反应器于1998年被描述，并被建立为搅拌槽生物反应器的替代品，用于昆虫和哺乳动物细胞的培养，如病毒和重组蛋白的生产。摇摆生物反应器最初是一次性使用的，采用一次性培养袋。但其在特定摇摆速度下的剪切力尖峰会出现共振现象导致不寻常行为，并且一些细胞沉积和微载体黏附在容器壁上。常见的摇摆生物反应器包括Cytiva 的Xuri细胞扩增系统(以前的WAVE生物反应器)和Cellbag容器，以及来自Sartorius的BiostatRM和Flexisafe RM袋(取代CultiBag)，覆盖的工作体积从50 mL到500L。
文中综述的应用有在Xuri细胞扩增系统中培养hESCs和hiPSCs聚集体（150mL、250mL、 1L），并使用灌注和非灌注细胞袋，进行连续传代和培养条件的优化；在摇摆反应器中进行hMSC的扩增（200mL和600mL改良细胞袋）及hHSPCs到红细胞生产的研究【1】。
图6.摇动生物反应器示意图
07 垂直轮生物反应器
(Vertical-Wheel bioreactors，VWBRs)
搅拌槽生物反应器是传统生物处理的常用方法，但其搅拌机制传递的高剪切应力，不适合干细胞等对剪切力敏感的细胞的培养。尽管已提到的大多数其他生物反应器通过不使用叶轮来避免这个问题，但这会损害传质并可能影响培养物的均匀性。PBS Biotech的垂直-轮生物反应器 (VWBR)克服了前几类生物反应器的较大缺陷，使用更温和有效的搅拌机制以提供均匀的培养环境，并实现不同规模上的有效放大（图7）。
容器内独特的垂直轮设计，其内部叶片和外部桨叶使容器内液流产生径向和轴向的混合；容器U形底部和相对大的叶轮直径形成较大的扫略体积，避免了叶轮下方的“死区”，限制了干细胞聚集体的沉降，总体上产生更有效的混合效果；另外使用低输入功率（搅拌速度），使传递到细胞的剪切应力更小。此外，叶轮的大尺寸允许其旋转能量在相当大的面积上耗散，相比于水平叶轮式生物反应器，其能量耗散率更低。此生物反应器是为一次性使用而开发的，涵盖前期工艺开发至临床和上市生产级别规格，有PBS Mini 0.1L和0.5L规格（研究级）、PBS 3L、15L和80L的GMP级生产规格，500L规格在概念验证中。所有体积反应器拥有相似的水动力条件，在逐渐放大的垂直轮生物反应器中具有良好的预测性能，实现真正的可放大性。
图7. 垂直轮生物反应器示意图
(a) 100ml容器，带底座; (b) 3L容器，带嵌入式控制器
目前，VWBRs基于CFD的流体动力学建模数据和实验数据所进行的特征描述愈来愈详尽。多篇hiPSC在垂直轮生物反应器中的培养数据，也展现出其优异的性能表现，包括细胞扩增能力、细胞质量保持、可重复性、稳定性和可放大性等，如图8所示，详细内容见参考文献【3】-【9】。此外，PBS反应器还有被报道用锚定依赖性细胞的扩增（如哺乳动物或人间充质干细胞）、造血干细胞以及外泌体的生产工艺开发等。具体出版物可参见原文参考文献【1】。
图8.关于近年发表的在不同的几何形状的生物反应器中3D悬浮iPSC扩增研究的汇总比较
引用自参考文献【3】
二、各生物反应器优劣势总结
生物反应器的选择取决于多种因素。现将前文中提到的各类生物反应器及其各自优点和局限性总结如下：
、
三、一次性生物反应器生产过程中的挑战
不论选择何种平台，一次性生物反应器工艺的整体发展，都存在以下挑战。大致总结为以下几点：
1.一次性部件材质的选择（如聚合物化合物）
用γ辐射进行灭菌或在培养条件下使用是否会导致这些聚合物降解，然后浸出到培养基。
2.可持续性
在一个过程中，可能处理数百或数千个一次性容器将导致更高的空间占用，因为这些容器含有扩增的细胞，被视为生物废物，不能回收、焚烧或送往垃圾填埋场。这些生物反应器的制造、包装、灭菌和运输也构成了可持续性限制。然而，对可重复使用和一次性使用系统中单克隆抗体和腺病毒疫苗生产的一组生命周期分析实际上得出结论，一次性使用过程在环境上更具可持续性。但它们的环境影响可以进一步减少，例如，确保生物生产设施尽可能靠近容器制造地点，并通过促进任何未受污染的部件(即包装和包装)的回收。
3.经济性
因为初始投资更少使一次性容器看起来比可重复使用容器更便宜，但每次生物反应器运行都需要新的容器，这可能会导致整个过程的运行成本更高。一次性生物反应器工艺成本的差异将取决于较低的初始投资和较高的耗材成本。其积极方面的影响也应考虑，如节省灭菌周期所需的时间和较低批次间受污染的潜在风险，以及使用一次性生物反应器的工艺可能面临更小的监管障碍，缩短产品上市时间。
4.质量源于设计框架
无论使用何种类型的生物反应器，干细胞生物制造过程的发展都受益于质量源于设计 (Quality by design,QbD)框架。其中操作区间保证在确保最终产品质量的同时允许过程中的一些灵活性。此外，质量控制被转移到工艺时间轴的上游，而不是限于产品层面，使得整个过程都受到质量控制，允许尽早地发现和规避问题。如果每个一次性容器的特性都包含在关键工艺参数中，QbD可以减轻可能的容器变化的影响。QbD还受到持续和迭代改进的推动-随着对过程有更多的了解，它可以被修改以解释这些新信息。因此，QbD是开发稳健的生物工艺的重要工具，减少产品质量控制和失败批次的费用，并允许进一步符合GMP指导方针。
四、结论
近年来，基于干细胞的疗法获得了很多关注。然而，干细胞及其衍生物的大规模制造过程所带来的诸多问题——比如对人类干细胞复杂性的有限认识；生物反应器提供的动态培养环境对细胞表型、活力或质量的影响；平台和试剂的高昂成本；从细胞作为工厂到细胞作为产品的范式转变，以及与这种转变相关的监管障碍，都减缓了它们向临床的过渡。
此外，细胞分化在许多情况下(即在所有涉及hPSCs的过程中)都是必需的，这增加了过程的复杂性，并且已经在2D中进行的各种研究可能难以转化为3D生物反应器环境。尽管如此，这些障碍中的一些正在被突破，并且已经有可能在不影响其质量的情况下生产临床规模数量的干细胞。事实上，大多数使用生物反应器培养干细胞及其衍生物的研究都对细胞表型和基因组完整性进行了评估。然而，仍然需要更全面的研究，例如静态与动态培养的蛋白质组学或转录组学分析，来充分了解生物反应器中存在的动态培养微环境对所生成细胞特性的影响。
虽然早期的报告采用可重复使用的生物反应器系统，但本文回顾的各种类型的一次性生物反应器已被建立为确保hPSC和hMSC扩增和分化的有效平台。此外，一次性生物反应器降低了最终产品污染的风险，从而允许更符合GMP生产过程要求。随着一次性使用系统的发展和对如何解决其局限性的更多见解被收集，它们可以预期在干细胞产品的建立中发挥重要作用，从而允许采取更多策略，实现再生医学的应用。
参考文献
【1】Diogo E S Nogueira et al. Single-Use Bioreactors for Human Pluripotent and Adult Stem Cells: Towards Regenerative Medicine Applications. Bioengineering (Basel),2021 May 17;8(5):68.
【2】Ayesha Aijaz et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nat Biomed Eng. 2018 Jun; doi: 10.1038/s41551-018-0246-6.
【3】Cuesta Gomez et al. Suspension culture improves iPSC expansion and pluripotency phenotype. Stem Cell Research & Therapy (2023) 14:154; doi:10.1186/s13287-023-03382-9.
【4】Nogueira et al. Strategies for the expansion of human induced pluripotent stem cells as aggregates in single-use Vertical-Wheel™ bioreactors. Journal of Biological Engineering. 2019.
【5】Brian Lee et al. Cell Culture Process Scale-Up Challenges for Commercial-Scale Manufacturing of Allogeneic Pluripotent Stem Cell Products. Bioengineering. 2022.
【6】Dang et al. Computational fluid dynamic characterization of vertical-wheel bioreactors used for effective scale-up of human induced pluripotent
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